糖蛋白在人体蛋白质中占据50%以上，是许多生物制药的重要成分。蛋白质的糖基化是众多翻译后修饰（PTM）中最为广泛且复杂的一种，对于调控各种生物过程至关重要。对糖蛋白的一级序列进行综合分析，包括糖基化位点的识别及相关的聚糖结构，是深入了解其功能的关键。

液相色谱-质谱法（LCMS/MS）已经成为识别蛋白质及其翻译后修饰的重要工具。不同于在糖蛋白质组学中常用的数据库搜索策略，从头测序是一种创新的方法，能够在没有事先了解DNA或氨基酸序列的情况下进行研究。然而，由于多糖基化位点的复杂性，序列覆盖的不足及游离寡糖修饰谱的不明确，使得获得信息丰富的糖肽碎片谱变得困难，从而限制了从头测序在具有一致结构和已知N-link糖基化位点的单克隆抗体（mAb）中的应用。

在2025年发表的“解码蛋白质糖基化的综合质谱法从头测序策略”中，介绍了一种通过质谱鉴定未知糖蛋白的新方法，该方法结合了去糖基和糖基化位点表征。通过N-/O-糖的去糖基化，研究者实现了全面的序列覆盖，并利用EThcD碎裂技术鉴定高质量的长肽，从而促进了精确的蛋白质组装。这一方法不仅适用于复杂糖基化融合蛋白依那西普（Enbrel），还应用于三种未知序列的新型肿瘤坏死因子受体Fc融合生物制剂，揭示了它们与依那西普之间的微小氨基酸变化。

为此，研究者采用了多种方法对依那西普及未知TNFR:Fc融合生物制剂进行了从头序列测定。首先，通过利用N-糖苷酶F（PNGaseF）去除N-聚糖，然后利用内切糖苷酶（EngEF）去除O-聚糖，结合唾液酸酶以确保去糖基化的效果，经过质量分析确认了去糖基化的成功。随后，使用EThcD碎裂技术获取高质量肽段，并通过PEAKSAB进行序列分析。此外，作者在含有18O的环境下处理样本，将糖基化的Asn转化为Asp并标记18O，进行定量分析。

该研究的结果表明，糖蛋白的从头测序方法不仅提高了氨基酸序列的识别率，还成功确认了糖基化位点的相关性。例如，在依那西普中发现至少有3个N和13个O-糖基化位点，进一步应用该方法研究三种未知TNFR:Fc生物制剂的序列时，揭示了特定氨基酸位点上的显著差异。这些发现为理解糖基化修饰对生物药物活性的影响奠定了基础。

文章最后，作者强调，基于质谱的从头测序方法是探讨氨基酸序列及糖基化的强大工具。结合从头测序及糖基化表征的创新策略开辟了研究高度糖基化蛋白质的新路径，尤其是南宫28为生物药物分析提供了全面的信息。这种方法不仅对基础研究有实用价值，也为生物制药行业中各种生物药物的开发与优化提供了新的框架。